贵州大学张利博/郝格非/上海人工智能实验室谈攀团队CEJ：AI挖掘高效几丁质酶实现四种壳二糖绿色制备，

提升水稻抗重金属胁迫能力

   全球农田重金属（以镉为代表）污染导致作物减产最高达50%，严重威胁粮食安全与农产品质量。镉胁迫通过芬顿反应诱发活性氧（ROS）过量积累，造成细胞膜脂质过氧化、蛋白与核酸损伤，最终抑制水稻生长、降低产量与品质。壳二糖作为最小单元壳寡糖，具备优异水溶性、生物相容性与抗氧化活性，其中四种精确结构异构体（AA/AD/DA/DD）存在显著功能差异，是极具潜力的植物抗逆生物刺激素。然而，高成本与合成技术瓶颈严重阻碍了对其构效关系的深入研究和农业应用。

   传统化学法、酶解法存在产物混杂、特异性差、成本高昂、分离困难等瓶颈，精确结构壳二糖的绿色规模化制备长期受限，其缓解水稻重金属胁迫的结构-活性关系与分子机制尚未系统阐明，制约了在农业绿色防控中的应用。

   几丁质酶催化水解是一条更具前景的途径，但现有酶存在副产物多、对固态底物效率低、稳定性差等问题，难以实现高纯度AA的规模化生产。此外，以AA为前体制备单乙酰化异构体（AD、DA）需要高度区域选择性的去乙酰化步骤，几丁质脱乙酰酶（如特异性不同的NodB和VcCDA）为此提供了可能，整合酶促级联反应被视为突破合成瓶颈的关键。

基于上述研究背景，贵州大学张利博/郝格非/上海人工智能实验室谈攀团队利用人工智能（AI）驱动的蛋白质语言模型挖掘策略，从 Paenibacillus elgii 中鉴定出一种新型内切几丁质酶CT10，并结合区域选择性脱乙酰酶，建立了一种绿色、经济的酶级联反应平台。该平台能以低成本甲壳素为原料，规模化生产四种结构明确的壳二糖（AA、AD、DA、DD）。研究发现其中DA具有最强的羟基自由基清除能力。在水稻镉胁迫实验中，外源施加这些壳二糖能有效缓解胁迫，恢复生长、降低氧化损伤并上调抗氧化酶基因表达，其中DA效果最显著。该研究为可持续农业提供了基于自然产物的作物抗逆新策略。

该研究已经于2026年4月4日发表于国际知名期刊《Chemical Engineering Journal》上，得到了国家重点研发计划、贵州省国际科技合作基地后补助基金项目、国家自然科学基金优秀青年科学基金项目以及贵州大学启动经费的资助。

示意图. (a) 通过酶筛选，鉴定出一种高稳定性和高效率的几丁质酶，用于从胶体甲壳动物几丁质生产壳二糖AA。(b) 通过探索几丁质酶-脱乙酰酶级联反应，一锅法合成AD、DA和DD。(c) 结构明确的壳二糖通过清除活性氧(ROS)和上调抗氧化酶，缓解水稻中的镉胁迫。

实验方案

    AI 辅助高效几丁质酶挖掘：基于VenusMine平台，以Chit33（PDB:7ZY9）为模板，通过FoldSeek 结构搜索 + MMseqs2 序列扩展 + ProstT5 结构感知嵌入 + ESM-1b 进化评分 + ColabFold 结构预测多级筛选，获得高特异性内切几丁质酶 CT10。

   分子机制模拟：使用AutoDock4.2进行底物对接，Amber24进行100 ns分子动力学模拟，分析底物在催化口袋中的稳定性。

   QM/MM计算：使用ChemShell结合DL-POLY和ORCA计算糖苷键断裂的能垒和拉普拉斯键级（LBO），阐明不同几丁质酶产物差异的分子机制。

   一锅法多酶级联制备精确结构壳二糖：耦合 CT10 与区域选择性脱乙酰酶（VcCDA/NodB），构建一步法酶级联反应体系，定向合成 AA、AD、DA、DD 四种高纯度壳二糖。

   体外抗氧化活性评价：水杨酸显色法与 ESR 电子自旋共振验证羟基自由基清除能力，DPPH 法评价广谱自由基清除活性。

   水稻抗镉胁迫功能验证：水培试验测定植株表型；检测 MDA、H2O2、脯氨酸及SOD/POD/CAT抗氧化酶活性；RT qPCR 分析抗氧化基因表达。

结果与讨论

PLM引导的几丁质酶计算发现

研究团队首先以已知的几丁质酶Chit33三维结构为模板，进行结构同源性搜索，从微生物基因组数据库中初筛出大量候选序列。随后，利用蛋白质语言模型（PLM）ProstT5将这些序列转化为数字化的“嵌入向量”，以捕捉其深层功能语义。通过聚类分析，从序列功能空间中挑选出15个具有代表性且与已知几丁质酶（EC 3.2.1.14）聚类关系紧密的候选者。系统发育树显示它们与Chit33亲缘关系各异，确保了多样性。

最关键的是结构层面的验证。催化口袋残基比对表明所有候选酶都保留了关键催化基团；而AlphaFold预测的顶级候选CT10与Chit33晶体结构的高度重叠，则从三维构象上证实了其作为几丁质酶的可靠性。

图1. PLM引导的几丁质酶计算发现

选定几丁质酶的生化与功能表征

研究团队首先通过SDS-PAGE证实了关键候选酶（Chit33、CT10、CT11）在大肠杆菌中成功实现可溶性表达，获得了纯净的蛋白用于后续研究。蛋白质热迁移分析直接测量了酶的构象稳定性，显示不同酶的热稳定性存在差异，这是工业应用的重要参数。酶活最适温度测定则确定了各酶发挥最大催化效率的适宜条件。

最关键的实验是产物分布分析，在标准条件下水解胶体几丁质，并通过薄层色谱（TLC）定性及定量分析产物。结果清晰显示，候选酶CT10生成目标产物—完全乙酰化的壳二糖（AA）—的效率显著高于其他酶，包括已知的Chit33。这些生化实验数据相互印证，共同确立了CT10为一株高效、稳定的几丁质酶，为将其确定为核心催化剂用于后续级联反应奠定了基础。

图4. 一锅法酶级联合成结构明确的壳二糖

四种结构明确壳二糖的羟基自由基清除活性

通过经典的羟基自由基清除实验进行定量分析，结果显示四种壳二糖均具有一定的抗氧化能力，但其活性强弱与乙酰化模式密切相关。其中，单边脱乙酰化的产物DA表现出最强的自由基清除能力，其效果甚至优于常用的抗氧化剂参照物L-抗坏血酸（L-AA）和谷胱甘肽（GSH），以及混合物壳寡糖（COS）。

为了验证这一化学分析结果的可靠性，研究进一步采用了电子自旋共振（ESR）光谱这一直接检测自由基的技术。ESR谱图清晰显示，DA处理组中代表羟基自由基的特征信号峰强度减弱最为显著，直观地证实了其高效的自由基清除功效。

图5. 四种结构明确壳二糖的羟基自由基清除活性

外源施加壳二糖改善镉诱导的水稻幼苗生长抑制

研究在水稻幼苗镉胁迫模型中，外源添加了四种壳二糖及阳性对照抗氧化剂。通过系统测量地上部（株高、鲜重、干重）和根系（根长、鲜重、干重）的生长指标，发现所有壳二糖处理均能在不同程度上缓解镉胁迫导致的生长抑制。

尤为重要的是，筛选出的抗氧化活性最强的DA，在促进生长方面也始终表现出最佳效果，其恢复效果与常用抗氧化剂L-AA和GSH相当甚至更优。该图从农业表型上直接证明，特别是DA，能够有效保护水稻免受镉毒害，维持其正常的生物量积累和根系发育，展现了其作为新型生物刺激剂或抗逆保护剂的巨大应用潜力。

图6. 外源施加壳二糖改善镉诱导的水稻幼苗生长抑制

外源施加壳二糖对镉毒性下水稻幼苗胁迫响应的机制解析

研究检测了三个层面的关键指标。

首先，氧化损伤标志物显示，DA处理能显著降低镉胁迫引起的膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的积累，并调节渗透调节物质脯氨酸的水平，表明其有效减轻了细胞氧化损伤。

其次，关键抗氧化酶（SOD, POD, CAT）的活性测定（d-f）发现，DA处理显著提升了这些酶的活力，增强了植株内部的主动清除自由基能力。

最后，在分子水平上，实时定量PCR分析表明，DA处理上调了编码上述抗氧化酶的基因（sod, pod, cat）的表达。

图7. 外源施加壳二糖对镉毒性下水稻幼苗胁迫响应的机制解析

本研究成功建立了一条从低成本甲壳素废弃物直接绿色生产结构明确壳二糖的可扩展酶级联路线，并系统揭示了四种壳二糖在缓解水稻镉胁迫中的构效关系。AI辅助发现的CT10几丁质酶具有高热稳定性、高产物特异性和高可溶性表达等优异特性，解决了传统几丁质酶产物不纯、效率低下的瓶颈。通过CT10与区域选择性脱乙酰酶的一锅法级联反应，实现了四种高纯度壳二糖的高效合成。生理和分子证据表明，壳二糖通过直接清除ROS和激活植物内源抗氧化防御系统的双重机制增强水稻对镉胁迫的耐受性，其中单乙酰化壳二糖DA在促进根系恢复和上调抗氧化酶基因表达方面效果较为显著。壳二糖有望作为一种新型天然生物刺激素，用于保障重金属污染农田的作物生产力，为可持续农业提供直接解决方案。

引用信息：

 Chemical Engineering Journal 536 (2026) 175906

DOI（在线访问）：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.175906

审校：吴增雪

编审：李向阳

终审：张    林